線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH-CoQ還原酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
紫外分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào)：BC0510
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：試劑放于瓶?jī)?nèi)玻璃管內(nèi)，臨用前取一瓶加入2 mL丙 酮，充分溶解，2-8℃可分裝保存1個(gè)月；

2. 試劑三：臨用前加入0.1mL丙 酮，丙 酮 易揮發(fā)，使用完畢后注意封口，-20℃可保存2個(gè)月；

3. 試劑三工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑三：丙 酮=10μL：1mL（約20T）混合備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4. 試劑四：臨用前取一瓶加入2.4mL蒸餾水（約30T），現(xiàn)用現(xiàn)配，充分溶解，-20℃可保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融；

5. 工作液的配制：根據(jù)用量將丙 酮：試劑二：試劑三工作液=250μL：250μL：500μL（約10T）混合備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：
復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5.3）又稱NADH-CoQ還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對(duì)電子從NADH傳遞給CoQ，同時(shí)可使O₂還原生成O^2-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O^2-的主要部位。測(cè)定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。
復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小。


注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、細(xì)胞超聲破碎儀、丙 酮、冰和蒸餾水。
操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1.0 mL提取液一，用勻漿器或研缽于冰上快速勻漿（約30次）。

2. 4℃ 600 g離心10min，棄沉淀，留上清。上清再次離心，4 ℃ 11000 g離心15min，得到上清液和沉淀。

3. 上一步結(jié)果得到的上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

4. 在沉淀中加入200μL提取液一和200μL 提取液二，超聲波破碎（功率200W，超聲5秒，間隔10秒，重復(fù)15次），用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測(cè)定，并且用于蛋白含量測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1. 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一37℃預(yù)熱15min。

3. 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入

三、復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T =3215.43×ΔA÷Cpr
V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過(guò)高（A1高于1.5），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）；若ΔA偏小，則可以通過(guò)增加加入的樣本體積來(lái)提高靈敏度。

2. 樣本蛋白濃度需自行測(cè)定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量（約0.5mg/mL）。

3. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活。另附按樣本計(jì)算公式和按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算公式

4. 附：使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為50T/24S） 

A、上清中復(fù)合體I活力的計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/g質(zhì)量）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=3215.43×ΔA1÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：
比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫?/span>一體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中復(fù)合體I活力的計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/g質(zhì)量）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：沉淀重懸體積（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
C、樣本復(fù)合體I總活力的計(jì)算：
樣本復(fù)合體I總活力即為上清中復(fù)合體I活力與沉淀中復(fù)合體I活力之和。
按樣本質(zhì)量計(jì)算：復(fù)合體I（U/g 質(zhì)量）=3215.43×ΔA1÷W+1286.17×ΔA2÷W

1. 附：使用細(xì)胞數(shù)量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為50T/24S） 

1. 上清中復(fù)合體I活力的計(jì)算：

單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V樣)÷T =3215.43×ΔA1÷N
ΔA1：上清測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫?/span>一體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；N：細(xì)胞數(shù)量，以10⁶計(jì)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

1. 沉淀中復(fù)合體I活力的計(jì)算:

單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V樣)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm d：比色皿光徑，1cm；V提取：沉淀重懸體積（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；N：細(xì)胞數(shù)量，以10⁶計(jì)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

1. 樣本復(fù)合體I總活力的計(jì)算：

樣本復(fù)合體I總活力即為上清中復(fù)合體I活力與沉淀中復(fù)合體I活力之和。
復(fù)合體I總活性（U/10⁶ cell）=3215.43×ΔA1÷N +1286.17×ΔA2÷N
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018.

2. Liuqin He,Haiwen Zhang, Xihong Zhou. Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. September 2018.

3. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018.

4. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

5. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

6. OuYang Q, Tao N, Zhang M. A damaged oxidative phosphorylation mechanism is involved in the antifungal activity of citral against Penicillium digitatum[J]. Frontiers in microbiology, 2018, 9: 239.

參考文獻(xiàn)：

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