亞鐵氧化酶（HP）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

貨號(hào)：BC4345

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑三：臨用前加入6 mL蒸餾水溶解備用，用不完的試劑2-8℃保存4周。

2、標(biāo)準(zhǔn)品：9 µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

亞鐵氧化酶（Hsphasetin，HP）是銅藍(lán)蛋白的同系物，催化亞鐵離子（Fe²⁺）氧化為三價(jià)鐵離子（Fe³⁺），從而三價(jià)鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞鐵釋放。

以一定濃度的Fe²⁺ 為底物，在亞鐵氧化酶的催化作用下Fe²⁺ 被氧化為Fe³⁺，Fe²⁺ 與菲咯嗪形成有色復(fù)合物，在562 nm處有特征吸收峰，先計(jì)算出未被氧化的Fe²⁺ 的含量，進(jìn)而得出被氧化的Fe²⁺ 的含量，可通過Fe²⁺被氧化的速率來(lái)反映亞鐵氧化酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照質(zhì)量（g）︰蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于10000 rpm，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、血清或血漿：建議用蒸餾水將血清或血漿稀釋2~4倍后直接檢測(cè)。若溶液渾濁則離心取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至562 nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將9µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水倍比稀釋為360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需40µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、 操作表：在1.5 mL離心管（分光光度計(jì)）或96孔板中依次加入下列試劑：

三、亞鐵氧化酶活性計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（nmol/mL）為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA測(cè)定帶入方程得到樣本濃度（x，nmol/mL）。

2、 亞鐵氧化酶活性的計(jì)算：

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg蛋白每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個(gè)酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V試劑二÷（V樣×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g樣品每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個(gè)酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/g鮮重）= x×V試劑二÷（V樣×W÷V提取）÷T×N = 1.667x÷W×N

（3）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺ 定義為1個(gè)酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= x×V試劑二÷V樣÷T×N = 1.667x×N

V試劑二：加入的試劑二體積，0.04 mL；V樣：加入的樣本體積，0.008 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間：3 min；N：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 當(dāng)A測(cè)定低于0.1時(shí)，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g結(jié)腸，進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定操作步驟，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定 =（A無(wú)基質(zhì)管-A空白管）-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）=（1.144-0.041）-（1.114-0.048）=0.037，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0031x - 0.0007，計(jì)算x=11.710，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

亞鐵氧化酶酶活（U/g質(zhì)量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×11.710÷0.1=195.161 U/g質(zhì)量。

2、 取兔血清，按照測(cè)定操作步驟，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=（A無(wú)基質(zhì)管-A空白管）-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）=（0.577-0.048）-（1.114-0.048）=0.574，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0031x - 0.0007，計(jì)算x=184.935，按照液體體積計(jì)算酶活得：

亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×184.935=308.287 U/mL

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