有效期
6個月
儲存條件
2-8℃
中文名稱
蛋白質(zhì)游離巰基含量檢測試劑盒微量法
單位
盒
英文名稱
Protein Free Thiol Content Assay Kit
檢測方法
微量法
規(guī)格
100T/48S
自備試劑
該試劑盒實(shí)驗過程中需自備試劑，詳情見網(wǎng)站說明書

產(chǎn)品型號：BC5895-100T/48S

更新時間：2024-04-15

廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家

訪問量：845

服務(wù)熱線

010-50973130

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產(chǎn)品分類

PRODUCT CLASSIFICATION

生化檢測試劑盒-微量法

水溶性物質(zhì)羥自由基清除能力血清（漿）二胺氧化酶（DAO）活性檢測盒微量法生化試劑盒

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產(chǎn)品介紹

蛋白質(zhì)游離巰基含量檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC5895
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

試劑名稱	規(guī)格	保存條件
提取液一	液體40 mL×1瓶	2-8℃保存
提取液二	液體40 mL×1瓶	2-8℃保存
試劑一	液體120 mL×1瓶	2-8℃保存
試劑二	液體20 mL×1瓶	2-8℃保存
試劑三	液體7 mL×1瓶	2-8℃保存
試劑四	液體1mL×1支	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品	粉劑×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

提取液配制：臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進(jìn)行配制，請勿一次性全部混合。
若試劑二有析出，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。
標(biāo)準(zhǔn)品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）。臨用前加入1.3mL蒸餾水配置成25μmol/mL，2-8℃保存4周。
0.125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取50μL 25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成1.25μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品；然后取100μL 1.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.125μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明：
巰基的存在使得蛋白質(zhì)能夠進(jìn)行二硫鍵的形成，從而維持分子的穩(wěn)定性和功能性。此外，巰基還參與到氧化還原反應(yīng)中，具有重要的生物學(xué)作用。在細(xì)胞內(nèi)，巰基含量的變化與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，因此巰基也成為了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要研究對象。本試劑盒測定的是蛋白質(zhì)中的游離巰基含量。
一定條件下巰基會發(fā)生親核反應(yīng)，即巰基與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰，據(jù)此可以計算蛋白質(zhì)游離巰基含量。

注意：實(shí)驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機(jī)、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、丙酮（AR）、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗,；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產(chǎn)生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。
細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，總時間3min）后，于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產(chǎn)生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。
血清/血漿、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙酮，4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗。（注：若測定數(shù)值偏小，可改變樣本與丙酮的比例，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮，注意同步修改計算公式）。

二、測定步驟

可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。
操作表：（建議在2mL的EP管中操作）

試劑名稱（mL）	對照管	測定管	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管
樣本	0.3	0.3	-	-
蒸餾水	-	-	0.3	-
標(biāo)準(zhǔn)品	-	-	-	0.3
提取液	0.18	0.18	0.18	0.18
請緩慢加入提取液混勻，并用吸頭反復(fù)吹打至氣泡不再產(chǎn)生（期間會有大量氣泡產(chǎn)生，開蓋放置）			-	-
試劑二	0.18	0.18	0.18	0.18
充分混勻，4℃ 3000rpm離心10min后取上清于1.5mL EP管/96孔板中			-	-
上清液	0.14	0.14	0.14	0.14
試劑三	0.06	0.05	0.05	0.05
試劑四	-	0.01	0.01	0.01
充分混勻，室溫靜置10min后，412nm下測定吸光度，分別記為A對照、A測定、A空白、A標(biāo)準(zhǔn)。計算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只需測1-2次。每個測定管需設(shè)一個對照管。

三、蛋白質(zhì)游離巰基含量的計算

按照樣本蛋白濃度計算：

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/mg prot）=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F
=0.125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×Cpr×F

按照樣本質(zhì)量計算：

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷W×F
=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

按照液體體積計算：

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/mL）=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷V液樣×F
=2.5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計算：

蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/10⁶ cell）=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷N×F=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F
C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.3mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；V試劑一：提取時加入試劑一體積，2mL；V液樣：提取時加入的樣本體積，0.1mL；F：稀釋倍數(shù)；N：細(xì)胞/細(xì)菌總數(shù)，以10⁶計。
注意事項：

若樣本ΔA測定<0.01，可適當(dāng)增大樣本量后測定，注意同步修改空白管和標(biāo)準(zhǔn)管及計算公式；若樣本ΔA測定>1.5，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測定，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。
可使用BCA法測定蛋白濃度。

實(shí)驗實(shí)例：

取100μL馬血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=A測定-A對照=0.113-0.047=0.066，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本液體體積計算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/mL）=2.5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F =0.529μmol/mL。
取0.1036g鼠肝，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=A測定-A對照=0.261-0.105=0.156，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本質(zhì)量計算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =1.207μmol/g 質(zhì)量。
取0.1078g黃豆粉，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測定步驟操作，用96孔板測得ΔA測定=A測定- A對照=0.123-0.070=0.053，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本質(zhì)量計算蛋白質(zhì)游離巰基含量得：蛋白質(zhì)游離巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.788μmol/g 質(zhì)量。