小鼠白細(xì)胞介素17A（ IL-17A）ELISA試劑盒

注意事項：※※※

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。

2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

4. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請 用移液器小心吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試 劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示：

試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操 作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本 及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

試劑盒組成及儲存

小鼠白細(xì)胞介素17A（ IL-17A）ELISA試劑盒

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清： 將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。

2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀， 請再次離心，避免反復(fù)凍融。

3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作 為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。 ※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo) 物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實 驗以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準(zhǔn)備：

1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn) 結(jié)晶，請放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍 濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待 其*溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，然后按照以下濃度：1000、 500、 250、125、 62.5、31.25、15.625、 0 pg/ml進(jìn)行稀釋。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）未用完的 應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃 縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶 結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。

酶結(jié)合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方法： ? 自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/ 孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。 ? 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

檢測步驟：

IL-17A Mouse ELISA Kit結(jié)果判斷：

1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行 雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。 2.計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值 3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中IL-17A含 量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。 4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

參數(shù)表征：

2. 靈敏度： 低可檢測小鼠 IL-17A 濃度達(dá) 8pg/ml， 20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。 3. 特異性： 不與小鼠 IL-1a、IL-1beta、IL-2、4、5、6、7、9、10、12、TNF-a 等反應(yīng) 4. 重復(fù)性： 板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10% 5. 回收率： 在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 IL-17A，計算回收 率。

6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 IL-17A，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動 力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評估線性。

小鼠白細(xì)胞介素17A