一、單細(xì)胞核提取的方法

1. Ficoll分層液法

Ficoll分層液法是一種單次密度梯度離心分離法.聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細(xì)胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll）,分子量為40kD,具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點(diǎn).高濃度的Ficoll溶液粘性高,易使細(xì)胞聚集,故通常使用60g/L的低濃度溶液,密度為1.020,添加比重為1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度.國外常用商品Isopaque或Hypaque,故又稱Ficoll-Hypaque分層液,將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液.分離人外周淋巴細(xì)胞以密度為1.077±0.001的分層液效果較好，因?yàn)槿说募t細(xì)胞密度1.093粒細(xì)胞密度為1.092，單個(gè)核細(xì)胞在1.076～1.090之間.而不同動(dòng)物血中的單個(gè)核細(xì)胞對分離液的密度要求各不相同，如小鼠為1.088,馬為1.090.分離時(shí)先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當(dāng)稀釋后,輕輕疊加在分層液上面,使兩者形成一個(gè)清晰的界面.水平式離心后,離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶.紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時(shí)因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底.血小板則因密度小而懸浮于血漿中,唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中,呈白膜狀,吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸.本法分離單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95％,淋巴細(xì)胞約占90％～95％,細(xì)胞獲得率可達(dá)80％以上,其高低與室溫有關(guān),超過25℃時(shí)會(huì)影響細(xì)胞獲得率.

2.Percoll分層液法

這是一種連續(xù)密度梯度離心分離法.Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒,對細(xì)胞無毒性.利用Percoll液經(jīng)高速離心后形成一個(gè)連續(xù)密度梯度的原理,將密度不等的細(xì)胞分離純化.用Percoll原液(密度1.135)與約等量雙離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液均勻混合,高速離心后,使分層液形成一個(gè)從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度,再將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液輕輕疊加在液面上,低速離心后,便得四個(gè)細(xì)胞層.表層為死細(xì)胞殘片和血小板,底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞,中間有兩層,上層富含單個(gè)核細(xì)胞(75％),下層富含淋巴細(xì)胞(98％).該法是純化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的一各較好的方法,但操作流程較長,手續(xù)較多

二、使用密度梯度離心法提取細(xì)胞核

操作步驟

1．用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。

2．將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入。

3．剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標(biāo)記，自然干燥。

4．將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機(jī)，以2500rpm，離心15分鐘；

(1)緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；

(2)同時(shí)涂一張上清液片②做好標(biāo)記，自然干燥；

(3)余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。

5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。6．將①、②、③涂片用l％甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。

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